廣州市天河區(qū)黃埔大道中124號(hào)2705室
電話：020-29031124
手機(jī)：18102256923
Email：servers@gzscbio.com
Fax：020-85625352
QQ：2913120624
在基因表達(dá)調(diào)控的研究中有各式各樣的方法，但究竟哪些方法應(yīng)用到哪些方向中呢？廣州賽誠(chéng)生物科技有限公司根據(jù)過(guò)往經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合當(dāng)今核心常用技術(shù)，做了以下總結(jié)。
1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控——蛋白調(diào)控DNA的研究方法
1.1 啟動(dòng)子：基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。
1.1.1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TSS
①預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子區(qū)域
②預(yù)測(cè)CpG島
（2）5’-RAce初步確定TSS的大概位置
（3）引物延伸、核酸酶保護(hù)或S1作圖精確定位TSS
1.1.2 啟動(dòng)子區(qū)域（順式作用元件）的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域
（2）克隆5’-flanking sequence，并連接到報(bào)告基因載體中
（3）缺失、突變
（4）熒光素酶活性分析
（5）確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(啟動(dòng)子區(qū)域)
1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子（反式作用元件）結(jié)合位點(diǎn)的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
（2）實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：EMSA，ChIP，DNase I足跡分析
1.1.4 反式作用元件和順式作用元件相互作用對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響
（1）定點(diǎn)突變：熒光素酶活性分析
（2）過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子：測(cè)定目的基因的表達(dá)
（3）干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)：測(cè)定目的基因的表達(dá)
（4）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
1.2 增強(qiáng)子：基因組中能增強(qiáng)鄰近基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的序列
（1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染——Luciferase熒光素酶法
（2）DNAase I hypersensitivity
（3）DNAase I footprinting/mutation analysis
（4）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控——蛋白調(diào)控RNA的研究方法
（1）RIP，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法
（2）RNA-Protein Pull-Down技術(shù)
其中，ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase、生物信息學(xué)等為其中的核心技術(shù)，也是未來(lái)的主要研究方法趨勢(shì)。接下來(lái)，廣州賽誠(chéng)生物科技有限公司針對(duì)這些核心技術(shù)作進(jìn)一步介紹。
1 免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation analysis，ChIP）
圖1 ChIP原理示意
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation ,簡(jiǎn)稱ChIP) 是一種在體內(nèi)研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的發(fā)明最早可以追溯到20世紀(jì)60年代,早期曾多用于研究核小體上的DNA和組蛋白的相互作用以及組蛋白的修飾。近年來(lái),此技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展和完善,特別是與DNA 芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合,可用于高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶點(diǎn)和研究反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況。該技術(shù)在國(guó)外已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,但在國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道,特別是在使用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶點(diǎn)方面,尚屬空白。
簡(jiǎn)而言之,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA 片段才能夠被沉淀下來(lái)，后解除偶聯(lián)、純化目的片段并檢測(cè)等步驟來(lái)獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
ChIP能捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)水平上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件，如實(shí)、完整地反映DNA與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合舊，但該方法尚存些不足，如：難以同時(shí)得到多個(gè)因子對(duì)同一序列結(jié)合的信息，或目標(biāo)蛋白不是直接地與染色質(zhì)結(jié)合等。研究者不斷地發(fā)展和完善此技術(shù)，建立了廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選的CHIP—chip(芯片)方法。該技術(shù)能夠快速在目標(biāo)基因組的染色體中確定特異DNA結(jié)合蛋白的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)， ChIP芯片也可以在一個(gè)基因組的任何感興趣的區(qū)域內(nèi)尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變。 ChIP-Chip被應(yīng)用于：
（1）在基因組范圍內(nèi)確定基因轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)和其他DNA結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合體的DNA結(jié)合位點(diǎn)。
（2）染色體活性狀態(tài)的定量分析。
（3）組蛋白修飾的功能研究。通過(guò)用酰基化或甲基化的組蛋白的特異抗體和沒(méi)有進(jìn)行修飾的組蛋白的特異抗體，可以確定與組蛋白修飾有關(guān)的結(jié)合模式的變化。
（4）聚合酶活性的定量分析。
（5）精煉生物信息方法，用功能數(shù)據(jù)來(lái)確定啟動(dòng)子的位置。
2 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法（RNA-Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）
圖2 RIP原理示意
RNA是一種不穩(wěn)定的生物大分子, 絕大多數(shù)的 RNA都需要與特定的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA/蛋白復(fù)合物才能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中; 不僅如此, RNA 與 RNA 結(jié)合蛋白之間的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)貫穿和伴隨了 RNA 的轉(zhuǎn)錄合成、加工和修飾、胞內(nèi)運(yùn)輸和定位、功能發(fā)揮及降解的整個(gè)生命循環(huán)。鑒于此, 利用 RNA 結(jié)合蛋白分離或發(fā)現(xiàn)鑒定功能性 RNA 分子是 RNA研究領(lǐng)域中一個(gè)不可或缺的研究方法。
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析；即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái)，結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
簡(jiǎn)單地說(shuō), 就是利用 RNA結(jié)合蛋白的抗體免疫沉淀 RNA/蛋白復(fù)合物, 再?gòu)某恋淼?RNA/蛋白復(fù)合物中分離得到特定 RNA結(jié)合蛋白的 RNA; 分離得到的 RNA可以通過(guò)末端標(biāo)記和變性膠電泳對(duì) RNA 分子的大小進(jìn)行鑒定, 也可以利用高通量 RNA 測(cè)序方法對(duì) RNA 序列進(jìn)行分析。
3 RNA-Protein Pull-Down技術(shù)
圖3 RNA pull-down原理示意
蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。了解它們之間相互作用的分子機(jī)制對(duì)理解這些生物學(xué)過(guò)程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性標(biāo)記，或?qū)嶒?yàn)步驟過(guò)多，不僅耗時(shí)費(fèi)力，也增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定。以末端標(biāo)記的RNA作為誘餌，輕松富集蛋白質(zhì)-RNA的相互作用。
RNA-Protein Pull-Down技術(shù)基本原理：使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。或?qū)?fù)合物洗脫后所得未知混合蛋白質(zhì)譜檢測(cè)。
4 電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoresis mobility shift assay，EMSA )
圖4 EMSA原理示意
電流遷移率變動(dòng)分析又稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shift assay)．是一種簡(jiǎn)單、快速和極為靈敏的體外檢測(cè)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的定性和定量分析，此外，也可以用于構(gòu)象變化的分析。
在EMSA實(shí)驗(yàn)中，純化的DNA特異結(jié)合蛋白或細(xì)胞粗提液和經(jīng)標(biāo)記的DNA或RNA探針一同溫育，在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離蛋白質(zhì)——DNA復(fù)合物和游離的探針。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)——DNA復(fù)合物的遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的大小、形狀、電荷和對(duì)稱狀態(tài)，它的遷移速度要比游離的DNA慢得多，從而在凝膠上形成滯后帶。我們根據(jù)所顯示滯后帶的有無(wú)和量的多少，來(lái)反映DNA結(jié)合蛋白與DNA探針的結(jié)合活性、 DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)水平，并可以計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù)或解離常數(shù)。
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來(lái)源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（ Tris-HCl或HEPES）、還原劑（ DTT）、甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA（ poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非離子去污劑。
EMSA結(jié)合反應(yīng)一般都要設(shè)置如下結(jié)合反應(yīng)： 1 ，陰性對(duì)照反應(yīng)（標(biāo)記探針）； 2，常規(guī)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針）； 3，探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針）； 4，突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針）； 5， Super-shift反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體）。
傳統(tǒng)的EMSA分析通常采用放射性同位素(如32p 3H)標(biāo)記的寡核苷酸探針，該方法雖靈敏性高、特異性強(qiáng)，但因同位素的半衰期短，且易于污染環(huán)境、危害身體等因素，在一般的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法進(jìn)行，其應(yīng)用的廣泛性受到了極大的限制。目前，人們已采用了地高辛和生物素標(biāo)記的寡核苷酸來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記的寡核苷酸，并在EMSA試驗(yàn)中獲得成功。同時(shí)基于EMSA的基礎(chǔ)上發(fā)展了超遷移率變動(dòng)分析 (supershift assay)和毛細(xì)管凝膠阻滯電泳，前者特異性要比EMSA好，常用于鑒定其他方法篩選出來(lái)的結(jié)果；后者樣品用量少、分辨率高，可用于一些受限制比較大的DNA——蛋白質(zhì)互作分析，如胚胎發(fā)育的研究過(guò)程。
5 Luciferase實(shí)驗(yàn)
圖5 Luciferase研究增強(qiáng)子原理示意
Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀測(cè)定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。
6 生物信息學(xué)方法及生物芯片技術(shù)
生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。它包含著生物信息的獲取、處理、存儲(chǔ)、分配、分析和解釋的所有方面。具體地說(shuō)，生物信息學(xué)是用數(shù)理和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)的生物學(xué)數(shù)據(jù)的一門(mén)學(xué)科。 Luscombe和Thornton利用氨基酸序列的保守性構(gòu)建計(jì)算機(jī)算法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合體中DNA 的結(jié)合位點(diǎn)。 Selvaraj等將蛋白質(zhì)/ 核酸復(fù)合體中原子電荷勢(shì)能作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，利用人工智能技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)DNA的識(shí)別位點(diǎn)。 Ahmad等將蛋白質(zhì)的序列組成、可溶解性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息數(shù)據(jù)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法進(jìn)行訓(xùn)練，構(gòu)建了在線蛋白質(zhì)/ 核酸結(jié)合預(yù)測(cè)技術(shù)，預(yù)測(cè)成功率達(dá)到了69%。此后Ahmad 和Sarai將此技術(shù)進(jìn)一步加強(qiáng)，在訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時(shí)加入了蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系的信息，使預(yù)測(cè)成功率提高了8.7%。目前建立在 蛋 白 質(zhì) / 核 酸 相 互 作 用 基 礎(chǔ) 上 的 較 重 要 的 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 為 蛋 白 質(zhì) , 核酸識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)能幫助研究者了解核酸被蛋白質(zhì)識(shí)別的機(jī)制。
7 DNase I 足跡法(DNase I footprinting)
圖6 DNase I 足跡分析
足跡試驗(yàn)的方法較多，常用的有DNase I足跡試驗(yàn)、硫酸二甲酯足跡試驗(yàn)(dimethylsulfate， DMS),二者原理基本相同,DNase I足跡法于1978年引入科研領(lǐng)域，其原理與DNA的化學(xué)測(cè)序法相似，首先將待測(cè)雙鏈DNA片段中一條鏈的一端選擇性地進(jìn)行標(biāo)記，然后加入恰當(dāng)濃度的DNaseI， 使在DNA鏈上形成缺口，經(jīng)過(guò)變性后電泳分離，放射自顯影，即形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA條帶。但當(dāng)DNA片段與相應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后， DNA結(jié)合蛋白可保護(hù)相應(yīng)的DNA序列不受DNase I 的攻擊，因此在放射自顯影圖譜上， DNA梯度條帶在相應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷，從而形成一空白區(qū)域，恰似蛋白質(zhì)在DNA上留下的足跡，因而被形象地稱作足跡法。如果同時(shí)進(jìn)行DNA化學(xué)測(cè)序，即可判斷出結(jié)合序列的精確順序，該技術(shù)至今仍然是最常用的方法，但是在實(shí)際應(yīng)用中，首先應(yīng)將序列特異蛋白進(jìn)行一定程度的純化，如硫酸銨分步沉淀，離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析等，否則很難得到滿意的結(jié)果。因此在該足跡法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了固相DNaseI足跡法，它具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)采用生物素進(jìn)行末端標(biāo)記，避免放射性同位素的摻人，減少危害； (2)省略了有機(jī)抽提、沉淀等蛋白純化步驟，操作簡(jiǎn)便，效率高； (3)使用范圍廣，可適用于未經(jīng)純化的核蛋白粗提物內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白的研究。
常與EMSA法結(jié)合共同用于體外DNA——蛋白質(zhì)相互作用的鑒定，但二者的側(cè)重點(diǎn)不同． EMSA主要用于與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白的檢測(cè)，而DNase I足跡法在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明了DNA元件和目標(biāo)蛋白的特異結(jié)合，并能告知與該蛋白結(jié)合的相應(yīng)DNA元件序列。
8 5’RLM-RACE技術(shù)
圖7 5’RLM-RACE技術(shù)
該技術(shù)主要用于確定TSS的大概位置。
9 酵母單雜交技術(shù)(yeast one hybrid system)
該技術(shù)是由Li JJ和Herskowitz I從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展來(lái)的。體外分析DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析，來(lái)鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。運(yùn)用此技術(shù)，能篩選到與DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫(kù)中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優(yōu)勢(shì)；而且，酵母屬真核細(xì)胞，通過(guò)酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。
酵母單雜交系統(tǒng)已被用于克隆多種重要的DNA結(jié)合蛋白，該系統(tǒng)相對(duì)直接、快捷、靈敏，篩選到的蛋白是在體內(nèi)相對(duì)天然條件下有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況，且無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作。但因細(xì)胞技術(shù)的先天局限性和所用報(bào)告基因His3或 lacZ的自泄漏表達(dá)等缺陷。在實(shí)際操作中常出現(xiàn)漏檢和假陽(yáng)性現(xiàn)象。
10 SELEX與核酸適體技術(shù)
用 于 DNA- 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 研 究 的 指 數(shù) 富 集 配 體 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX)技術(shù)誕生于上世紀(jì)90年代初，目前已經(jīng)成為在數(shù)量眾多的靶分子中，高親和性和特異性地確定適配了的一種嶄新的方法。 SELEX的流程即是人上合成隨機(jī)寡核苷酸序列、適配子篩選、擴(kuò)增、再循環(huán)的過(guò)程。在這一過(guò)程中，適配子修飾基團(tuán)文庫(kù)的應(yīng)用，使得SELEX流程更加經(jīng)濟(jì)，快捷，高通量。
SELEX是一種新型的體外篩選技術(shù)，它以DNA與蛋白質(zhì)相互作用為基礎(chǔ)建立隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，從中篩選到能與各種配體(靶蛋白)特異性結(jié)合的單鏈寡聚核苷酸片段，長(zhǎng)度一般為20～40bp，該寡核苷酸片段就稱為核酸適體(aptamer)。
SELEX技術(shù)的基本原理：首先人工合成一個(gè)含有1013～1015個(gè)單鏈寡核苷酸序列的隨機(jī)文庫(kù)，序列長(zhǎng)度往往在25～35之間。而單鏈的隨機(jī)寡核苷酸序列，尤其是RNA，容易形成可與蛋白質(zhì)、核酸等靶物質(zhì)特異性共價(jià)結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡(hairpin)、莖環(huán)(stem-loop))、 G-四聚體(G-tetramer)等等。在這一高親和力特異性結(jié)合的基礎(chǔ)之上，靶物質(zhì)如氨基酸、多肽、甚至金屬離子都可以同隨機(jī)文庫(kù)(池)相互作用，選擇性分離出適配子，然后通過(guò)PCR等建立在轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上的技術(shù)，生成次一級(jí)文庫(kù)，再與靶物質(zhì)結(jié)合，反復(fù)多次循環(huán)，即可獲得與靶物質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的適配于。
在這一過(guò)程中，隨機(jī)序列寡核苷酸文庫(kù)在一個(gè)給定溫度的選擇性緩沖液池中，可以同靶物質(zhì)親和作用的特異性序列非常少，只有通過(guò)物理分離技術(shù)加以純化。大分子如蛋白質(zhì)可以通過(guò)硝酸纖維膜過(guò)濾；小分子如核酸、多肽等，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的修飾，添加上可以與固相支持物產(chǎn)生親和作用的基團(tuán)，經(jīng)簡(jiǎn)單的沖洗即可以達(dá)到純化目的。高親和性適配子的富集效率，取決于多重循環(huán)中每一次循環(huán)的嚴(yán)緊性，經(jīng)過(guò)多次的選樣性分離擴(kuò)增后，達(dá)到了飽和狀態(tài)，富集的文庫(kù)被克隆，相應(yīng)的序列信息也被獲得。
適配子純化循環(huán)的次數(shù)取決于每一次循環(huán)的嚴(yán)緊程度。一般而言，對(duì)于大多數(shù)靶物質(zhì)在8～1 5次循環(huán)中剛可得到親和富集， 2天內(nèi)可完成一次SELEX循環(huán)，包括克隆和測(cè)序。一個(gè)典型的SELEX過(guò)程可能持續(xù)2～3個(gè)月。一旦序列確定，適配子可由化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)，少量適配子的純化和分析不超過(guò)3天，可以產(chǎn)生足夠數(shù)量(幾個(gè)摩爾)的適配子用于后繼的開(kāi)發(fā)和研究。最近SELEX過(guò)程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，將人為因素的干擾減少到最低。在微型自動(dòng)化分析儀上可同時(shí)執(zhí)行多個(gè)獨(dú)立的重復(fù)SELEX過(guò)程，使適配子的發(fā)現(xiàn)更加快捷、經(jīng)濟(jì)和高通量。
據(jù)此，其篩選過(guò)程可簡(jiǎn)單歸納為： (1)體外合成含1013～1015個(gè)單鏈寡核苷酸序列的隨機(jī)文庫(kù)； (2)在適宜條件下，孵育單鏈寡核苷酸庫(kù)與靶蛋白形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物； (3)分離未與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸； (4)解離與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異結(jié)合的寡核苷酸庫(kù)，再進(jìn)行下輪的篩選過(guò)程； (5)通過(guò)反復(fù)篩選與擴(kuò)增，得到親合力強(qiáng)于抗原抗體之間的高特異核酸適體。
核酸適體技術(shù)已成為適配體篩選的有效工具，其所結(jié)合的靶分子范圍非常廣泛，除蛋白質(zhì)之外，還可以是酶、核酸、細(xì)胞黏附分子、植物凝集素、病原菌、有機(jī)物甚至是金屬離子等，且篩選到的適配體能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)。基于這些特性，核酸適體技術(shù)已在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物篩選、生物傳感器等領(lǐng)域應(yīng)用。但需注意的是， SEIZX技術(shù)是體外實(shí)驗(yàn)，其篩選到的核酸適體所表現(xiàn)出的一些優(yōu)良性質(zhì)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)完全失效；核酸適體與靶分子的非特異性結(jié)合及適配體的同源性、親和力等的影響，造成了SELEX的前期篩選工作的復(fù)雜性。這也是SELEX技術(shù)亟待解決的兩個(gè)問(wèn)題。如果完成適配體的各種有效修飾及安全的藥物評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建， SELEX技術(shù)存在的問(wèn)題也將逐步解決。
11 熒光技術(shù)
該技術(shù)已廣泛用于生物分子之間的相互作用研究。由于核酸及其鏈上的堿基的熒光產(chǎn)率很低，蛋白質(zhì)組成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然熒光，所以采用“內(nèi)源熒光”的分析方法受到了很大的限制。用于研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的熒光法，主要是將熒光物質(zhì)修飾到蛋白質(zhì)或核酸分子上構(gòu)成新型熒光標(biāo)記物質(zhì)并結(jié)合相關(guān)儀器而改造成新型的檢測(cè)技術(shù)。它對(duì)待測(cè)物質(zhì)的濃度要求低，靈敏度高且部分熒光技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)分析等，基于這些優(yōu)點(diǎn)，在短短的幾年內(nèi)得到了迅速發(fā)展。
激光誘導(dǎo)熒光(Laser Induced Fluorescence． LIF)技術(shù)是常用的熒光技術(shù)之一，其靈敏度非常高，濃度檢出可達(dá)到10。13mol／ L，對(duì)于某些熒光效率高的物質(zhì)甚至可達(dá)單分子探測(cè)水平，且檢測(cè)時(shí)間短、樣品需要量少、可在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。目前， LIF常與毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis， CE)連用形成毛細(xì)管電泳聯(lián)合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)CE-LIF，該技術(shù)成為生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等高靈敏檢測(cè)領(lǐng)域的首選技術(shù)之一。
12 掃描探針顯微技術(shù)
掃描探針顯微鏡(Scanning probe microscope． SPM)是掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope， STM)、原子力顯微鏡(atomic force microscope， AFM)、掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(scanning near-field optical microscope， SNOM)、彈道電子發(fā)射顯微鏡(ballistic electron emission microscope， BEEM)、掃描力顯微鏡(scanning force microscope， SFM)
等一系列儀器的總稱，是上世紀(jì)被國(guó)際科學(xué)界公認(rèn)為80年代世界十大科技成就之一。它利用探針尖端與樣品分子間的相互作用對(duì)生物分子進(jìn)行成像，并以原子或分子分辨率探測(cè)生理環(huán)境下的生物表面力，所以通過(guò)該技術(shù)可觀察單個(gè)原子層的局部表面結(jié)構(gòu)，得到直觀的表面三維圖像和相關(guān)的表面結(jié)構(gòu)的信息，亦可以在生理?xiàng)l件下連續(xù)觀察生物樣品，了解某些生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。其中，原子力顯微鏡(AFM)在研究DNA-蛋白質(zhì)的相互作用方面有著較廣泛的應(yīng)用，它能對(duì)每一個(gè)DNA、蛋白分子以及DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體分別觀察并進(jìn)行定性和定量分析，提供更多真實(shí)直觀的信息。
SPM作為一種嶄新的技術(shù)手段，在研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的領(lǐng)域起到越來(lái)越重要的作用，但尚存在一些不足，如SPM掃描速度過(guò)低，滿足不了細(xì)胞內(nèi)的分子反應(yīng)速度；體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾鎸?shí)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)過(guò)程，固定表面的存在對(duì)DNA-蛋白質(zhì)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生哪些影響等問(wèn)題尚未清楚。
13 生物質(zhì)譜技術(shù)和表面等離子共振技術(shù)
生物質(zhì)譜技術(shù)采用先進(jìn)的軟電離技術(shù)使過(guò)去主要用于小分子研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了重大變革，它主要包括電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry， ESI—MS)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption／ ionization mass spectrometry， MAIDI—MS)、快原子轟擊質(zhì)譜(fast atom bombardment mass spectrometry， FAB—MS)和同位素質(zhì)譜(istope mass spectrometry)等，這些技術(shù)準(zhǔn)確度、靈敏度和自動(dòng)化程度高，對(duì)于研究結(jié)合位點(diǎn)十分有效，已成功地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的分析。
表面等離子共振(surface plasma resonance， SPR)是近年來(lái)新技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一，它利用入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面(比如玻璃表面的金或銀鍍層)時(shí)所引起金屬自由電子的共振而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱甚至完全消失的物理現(xiàn)象，來(lái)獲取生物反應(yīng)過(guò)程中樣品的折射率與共振角(即反射光完全消失時(shí)的入射光角度，又稱SPR角)的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)。 SPR技術(shù)可以原位、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)地反映蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、新藥分子-疾病靶蛋白等生物分子間的互作信息，是分子間互作研究的有力手段，已廣泛地用于研究生物分子間的識(shí)別和特異性作用。